Medical practices evolved over millennia, from ancient civilizations like Egypt and Mesopotamia to the groundbreaking
綜述：
本篇文章綜述了蛋白質純化策略中必須考慮的兩個關鍵因素：下游應用需求和蛋白質自身的生物學特性。文章強調，高質量的蛋白質純化是確保實驗數據可靠性和可重復性的基礎，尤其針對重組蛋白質的生產。不同應用場景對蛋白質的純度、活性或內毒素含量等有特定要求，而蛋白質本身的特性也會顯著影響純化策略的設計。文章通過具體案例說明，針對不同蛋白質的獨特性質需采用定制化純化方案。最后，提出了一套系統化的蛋白質生產流程（圖1），強調從表達系統選擇、構建設計到純化優化的全程質量控制，并推薦通過生物物理技術（如SEC-MALS、DSF等）評估蛋白質的均一性和功能性。本文旨在為研究人員提供實用指導，幫助其根據目標蛋白質的特性和應用需求，制定高效、可重復的純化策略，從而提升科學研究的質量和效率。
圖1.蛋白質生產流程示意圖
高要求蛋白質生產——問題識別、緩解策略設計和相應輸出的示例
1.核酸結合蛋白質：
在純化核酸結合蛋白時，需多步驟去除核酸污染。裂解時需添加核酸酶（如Sm核酸酶（benzonase?）或DNase或RNase），但無法完全去除結合態核酸。替代核酸去除步驟，如PEI或鏈霉素硫酸鹽沉淀、肝素純化或離子交換色譜步驟。通過A260nm/A280nm比值監測整個純化過程中核酸的存在，比值低于0.6，表明蛋白質純度較高，核酸污染最小。對于強結合核酸的蛋白，可短暫變性（如尿素處理）后復性。關鍵點：使用高質量試劑、新鮮緩沖液和和干凈的柱子（使用前用0.5M NaOH清洗）。
2.小鼠鐵蛋白重鏈1：
生產純化的小鼠鐵蛋白重鏈1（mFth1）蛋白的目的是用于高分辨率單顆粒冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）。大腸桿菌表達載體編碼無標簽的mFth1，在不添加任何核酸酶的情況下超聲破碎細胞，70°C加熱后，進行硫酸銨沉淀、透析和尺寸排阻色譜步驟，得到的樣品在冷凍電鏡圖像中顯示出大量污染物的存在（圖2A），完全不適合其用途。優化步驟，在細胞裂解過程和硫酸銨沉淀后的透析過程中添加Sm核酸酶，隨后添加陰離子交換色譜步驟，使A260nm/A280nm比值從1.4降至0.8。經尺寸排阻色譜后，最終mFth1樣品的A260nm/A280nm比值為0.56，SDS-PAGE及冷凍電鏡圖像（圖2B）顯示蛋白質非常純凈，表明污染物已被有效去除。
圖2.小鼠鐵蛋白重鏈1
3.嵌合蛋白人dsRBEC（dsRBD-EGF-嵌合體）：
dsRBEC由人類蛋白激酶R的雙鏈RNA結合域（dsRBD）和人類表皮生長因子（hEGF）融合而成。dsRBD在大腸桿菌中表達時顯示出極高的dsRNA結合能力，細胞裂解后，污染物RNA會阻礙重組蛋白與固定金屬離子親和色譜（IMAC）柱的結合。PEI或鏈霉素硫酸鹽沉淀、RNase處理或高鹽緩沖液等常規方法無法去除RNA。使用含有4M尿素的緩沖液進行細胞裂解，上清液加載到IMAC柱上，4M到0M尿素緩慢過夜（柱上復性），用復性緩沖液加咪唑從IMAC柱上洗脫，Superdex 75凝膠過濾進行最終精制，獲得具有功能活性的dsRBEC。
4.結合二價陽離子或其他輔因子的蛋白質：
對于與Zn2+、Fe2+、Cu2+等二價陽離子或其他輔因子相互作用的蛋白質，在表達過程中添加特定的二價陽離子（或其他輔因子）至關重要，在純化過程中也需要少量相同的二價陽離子（或其他輔因子），但必須避免使用任何螯合劑（如EDTA、EGTA）和具有螯合特性的還原劑（如DTT或DTE）。在處理結合二價陽離子的蛋白質時，必須使用無螯合劑的蛋白酶抑制劑混合物，通過光譜學方法（如原子吸收分光光度法）確認純化蛋白質中二價陽離子（或其他輔因子）的實際存在。
5.來自嗜熱藍藻Mastigocladus laminosus含有單個[2Fe±2S]簇的重組鐵氧還蛋白（rFd）
鐵氧還蛋白是可溶性鐵硫蛋白，參與電子轉移反應。植物型鐵氧還蛋白攜帶單個[2Fe±2S]簇，作為光系統I的電子受體。大腸桿菌BL21（DE3）菌株在含有10mM FeCl3和抗生素的TB培養基中表達重組rFd蛋白。使用含有10mM組氨酸的緩沖液進行IMAC捕獲柱的洗脫，避免咪唑，防止破壞[2Fe±2S]簇。陰離子交換和尺寸排阻色譜進一步純化，濃縮至12mg/mL用于結晶篩選。與重組生產的鐵氧還蛋白相比，從藍藻Mastigocladus laminosus純化的天然鐵氧還蛋白結晶時獲得了更高的分辨率。
6.用作抗原的蛋白質
蛋白質常被用作抗原以回收靶標特異性配體。首先需要考慮的是蛋白質是用于體內免疫以獲得常規單克隆或多克隆IgG，還是用于涉及駱駝IgG或體外選擇過程的程序。
6.1用于常規抗體生產的抗原
當抗原用于生產單克隆IgG抗體時，抗原正確折疊通常非必需，因多數單抗識別線性表位，這些表位受抗原結構的影響不大，甚至變性抗原（如包涵體蛋白）仍有效。但需嚴格把控純度，避免強免疫原性污染物干擾免疫應答，導致非目標抗體優勢產生。
6.2結合物庫的篩選
在駱駝免疫獲得的納米抗體庫處理過程中需特別注意保持抗原的天然構象。與常規抗體不同，駱駝抗體（尤其是納米抗體）傾向于識別結構表位，這與其獨特的凸狀互補位結構相關。類似地，在體外篩選大型合成或天然抗體庫時，抗原必須保持與目標應用完全一致的結構。由于篩選過程本身無偏向性，若抗原存在錯誤折疊、聚集或構象異質性，可能大量篩選出針對非天然表位的結合物。
7、含有分子間或分子內二硫鍵或游離半胱氨酸的蛋白質
二硫鍵對于穩定蛋白質的天然結構至關重要。在純化過程中，純化含有分子間或分子內二硫鍵的蛋白質時必須避免添加還原劑，避免蛋白質構象變化，從而改變蛋白質的功能。對于含有游離半胱氨酸的蛋白質，在純化過程的所有步驟中，尤其是在儲存過程中，還原劑必不可少，以免形成人工二硫鍵。最常用的還原劑是二硫蘇糖醇（DTT）、β-巰基乙醇（β-ME）和三（2-羧乙基）膦鹽酸鹽（TCEP）。對于與DTT或TCEP不兼容的IMAC樹脂，建議使用β-ME，并在后續步驟中用其他還原劑替換。
8、重組抗體片段
重組抗體片段（如納米抗體）雖然結構較IgG簡化，但其功能依賴于二硫鍵的正確形成。在細菌表達系統中，即使采用優化策略，仍可能產生錯誤折疊或部分折疊的產物，這些產物既存在于可溶部分也存在于包涵體中。更隱蔽的是，即使正確折疊的抗體片段也可能通過表面疏水斑塊形成可溶性聚集體（膠體聚集）。這類聚集體在常規功能檢測（如ELISA）中難以識別，因為多價結合可能掩蓋單體親和力的下降，但其存在會嚴重影響依賴小分子尺寸的應用（如超分辨率顯微鏡）。因此，僅依靠SDS-PAGE不足以評估樣品質量，必須采用凝膠過濾等生物物理方法（圖3）來區分單體（主峰）與聚集體（排阻體積峰）。關鍵控制點包括：表達時優化氧化還原環境以促進二硫鍵形成，以及純化后優化儲存條件防止聚集。這些措施對確?？贵w片段的單分散性和功能至關重要。
圖3.納米抗體可溶性聚集體的凝膠過濾分離
9、淋巴細胞受體LLT1的可溶性片段
重組表達依賴二硫鍵的蛋白質（如淋巴細胞受體LLT1）常面臨折疊難題。野生型LLT1的凝膠過濾顯示聚集峰和二聚體峰（圖4A），但質譜揭示二聚體中仍存在未配對半胱氨酸導致的錯誤折疊（圖4B）。為此設計兩種突變體：一個去除問題半胱氨酸導致產量驟降（圖4A）；而另一個引入新半胱氨酸重建保守二硫鍵后，突變體不僅產量高、穩定性好，還能結晶（圖4C），且3D結構證實該突變體形成正確二硫鍵并保持天然折疊。這一案例表明，通過合理設計保守二硫鍵，結合凝膠過濾和質譜分析，可有效解決重組蛋白的折疊問題，獲得結構穩定、高產的功能性蛋白。
圖4.二硫鍵重構改善可溶性LLT1的折疊與得率
10、易聚集蛋白質
重組蛋白純化常面臨聚集問題，其形成遵循"成核-生長"機制——少量可溶性聚集體先形成，隨后引發大規模不溶聚集。為應對這一挑戰，需采取多層面策略：在表達階段，可通過優化菌株、降低培養溫度、使用改良的培養基或不同的增溶性融合蛋白、替代表達系統（昆蟲/哺乳動物細胞）等；在純化階段，需快速操作（4℃環境）、避免蛋白過濃，并采用"快速純化策略"（如IMAC直接銜接SEC）及時去除聚集體核。一般來說，緩沖液篩選應考慮組分組成、pH值、離液劑或促溶劑等因素（圖5）。通過正交檢測（SEC、CD、LS、DSF及基于熒熱的溫度位移等）精細優化，確定蛋白質質量和最合適的緩沖液。
圖5.緩解蛋白質聚集的策略
11、人CLK1激酶的結晶（如何獲得可重復批次）
為獲得均質非磷酸化CLK1激酶用于結晶研究，采用多策略協同方案，首先在大腸桿菌中與λ-磷酸酶共表達以消除自磷酸化異質性，雖降低產量但確保去磷酸化完全。經IMAC捕獲后，洗脫液補充穩定劑（50mM精氨酸、50mM谷氨酸和10mM DTT）防止聚集，濃縮，TEV酶切去除His標簽，再通過SEC（含5%甘油和β-ME）分離正確寡聚體。最后的關鍵性陰離子交換步驟區分可結晶（非磷酸化）與不可結晶（部分磷酸化）CLK1群體。特別值得注意的是，細胞裂解方式顯著影響蛋白穩定性——高壓高溫法導致CLK1不可逆聚集，凸顯了溫和處理對激酶制備的重要性。
12、生產穩定、配體結合能力的Galectin-1
為制備功能性Galectin-1用于配體結合研究，比較了四種構建體（無標簽和His標記的野生型Galectin-1，無標簽和His標記的無半胱氨酸突變體Galectin-1）的表達純化策略。關鍵發現表明：基于乳糖親和層析純化能有效篩選正確折疊的蛋白，但需配合徹底透析（HEPES緩沖液）以完全去除結合位點中的乳糖，恢復CRD活性。野生型Galectin-1易氧化失活，即使在還原劑存在下穩定性仍有限（圖6），而無半胱氨酸突變體通過消除二硫鍵依賴性，在保持與野生型相當的凝集活性和熱穩定性（經nanoDSF、ITC等驗證）的同時，顯著提升長期穩定性。
圖6.重組Galectin-1流體力學表征揭示其不穩定性
13、內毒素去除
內毒素去除方法基于包括帶正電荷的層析（陰離子交換）、使用聚陽離子配體（如聚-L-賴氨酸（PLL）、固定化聚胺（多粘菌素B））的親和層析、添加表面活性劑Triton X-114。純化過程中注意使用LPS-free水制備緩沖液，使用新柱或僅在其他LPS-free純化中使用過的柱子。對于內毒素污染，可在0.5M NaOH中孵育色譜泵/流體系統過夜或在1.0M NaOH中孵育4小時。使用鱟試劑（LAL）評估樣品中LPS的最終量，并驗證其是否低于特定應用所需的限制。
14、蛋白質復合物
蛋白質復合物的表達和純化需根據具體條件優化，挑戰包括亞基的不穩定性或錯誤折疊?？梢詥为毐磉_各個亞基并在體外組裝，或者共表達各個亞基以形成功能性蛋白質復合物。構建設計需謹慎引入純化或檢測標簽，避免干擾組裝，尤其在復合物信息有限時需多次優化。純化過程中需評估復合物完整性和穩定性，方法包括SDS-PAGE（亞基檢測）、SEC（均質性）、SEC-MALS（摩爾質量分析）、質量光度法或天然質譜（質量驗證）。需注意低濃度下復合物可能解離，此時需優化層析方法或緩沖液（如通過熱漂移或DSF篩選條件）。此外，減少純化步驟可避免弱相互作用亞基丟失，平衡純化效率與復合物完整性。
15、抗原-抗體復合物的純化
抗體-抗原復合物是蛋白質復合物的典型范例，其共結晶可揭示結合模式，指導抗體工程化優化。傳統方法需分別純化抗原和抗體后混合，但近年研究表明共表達與共純化策略更為高效，僅需單次純化即可獲得復合物，同時能通過抗體穩定不穩定抗原，甚至實現無標簽表達。在這種特定情況下，SDS-PAGE和凝膠過濾（SEC）通常足以評估復合物純度和質量。
總結
蛋白質純化是科學研究的基礎技術，學術規模的蛋白質生產通常遵循標準策略，可產出毫克級高純度、可溶性蛋白，廣泛應用于結構生物學、生物化學和功能研究。然而，下游應用的特殊需求（如動物實驗要求無內毒素、核酸研究要求無核酸酶污染）或蛋白質本身的特性（如易聚集、含二硫鍵或高核酸親和力）往往需要定制化方案。本篇綜述針對這些特殊情況，提出從表達系統選擇、構建體設計（優化標簽和結構域邊界）到純化流程的精細化策略，并在關鍵步驟引入質量控制（如SEC、SDS-PAGE、活性檢測等）。某些應用還需額外分析（如內毒素檢測、核酸殘留測定），類似生物制藥行業的“質量保證”（QA）理念，即通過系統化流程預防缺陷。通過制定質量控制指南并明確科研用蛋白試劑的特定標準，旨在為學術實驗室建立更嚴謹的蛋白質純化規范，提升實驗數據的可靠性和可重復性，彌合基礎研究與工業標準之間的差距。
DOI: 10.1186/s12934-022-01778-5
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